神宗對張居正的反感，固不僅因為他輔教嚴厲，而且在知人事以後，發覺他滿嘴仁義道德，而行事不符所言。先談顧命一事：當穆宗駕崩時，召內閣大學士受顧命，照資望以高拱為首，其次張居正，再次高儀。明朝首輔權重，而張居正又是不甘居于人下的，因此與高拱平日就不睦，壞在高拱不了解張居正居心深刻、手段毒辣，以致甫受顧命即遭斥逐。《明史紀事本末》記：
上（穆宗）不豫，己酉大漸，召閣臣高拱、張居正、高儀至乾清宮受顧命……上困甚，太監馮保宣顧命。翌日，上崩。六月甲子，皇太子即位，年始十歲，時太監馮保方居中用事，矯傳大行遺詔曰：“閣臣與司禮監同受顧命。”廷臣聞之俱駭。一日，內使傳旨至閣，拱曰：“旨出何人？上沖年，皆若曹所為，吾且逐若曹矣！”內臣還報，保失色，謀逐拱。拱與居正俱負氣不下，居正乃結保自固。……拱內慮保專恣，與居正、儀謀去之。居正陰泄之保，乃與保謀去拱。六月既望，昧爽，拱在直，居正引疾。召諸大臣于會極門，促居正至。拱以為且逐保也，保傳皇後、皇貴妃、皇帝旨曰：“告爾內閣、五府（高陽按：前後左右中五都督府）、六部諸臣，大行皇帝賓天先一日，召內閣三臣禦榻前，同我母子三人，親受遺囑曰：‘東宮年少，賴爾輔導！’大學士拱攬權擅政，奪威福自專，通不許皇帝主管。我母子日夕驚懼，便令回籍閑住，不許停留。爾等大臣受國厚恩，如何阿附權臣，蔑視幼主？自今宜洗滌忠報，有蹈往轍，典刑處之。”拱即日出朝門。
馮保此舉自然出于張居正的主謀，而成事的關鍵，在于神宗生母要結外援才能強化她的母以子貴的地位。清朝咸豐十一年“辛酉政變”，慈禧太後與恭王取得聯絡，回鑾之日出密詔捕誅肅順，整個謀略就是此案的翻版。
神宗最初敬禮張居正，頗見至誠。萬曆元年，也就是神宗十一歲那一年，命成國公朱希忠、大學士張居正知“經筵”——為皇帝進講詩書，稱為“經筵”；以神宗沖年而論，則張居正實為“師傅”，與平常的“經筵講官”性質大不相同。有一天張居正忽然不舒服，大概是感冒之類，在直廬休息，神宗親到暖閣，手調椒湯以賜；夏天進講，特命太監為他打扇，冬天則以氈片鋪地。